Na het uitbreken van de Tweede Wereldoorlog ging de HMS Ajax patrouilleren in de wateren rond Zuid-Amerika, waar ze de Duitse koopvaarder Olinda tot zinken bracht en de Duitse koopvaarder Carl Fritzen en het passagiersschip Ussukuma onderschepte. Deze twee schepen brachten zichzelf tot zinken om te verhinderen dat de schepen door de Royal Navy gebruikt konden worden.
Tijdens de jacht op de Admiral Graf Spee was HMS Ajax het vlaggenschip van commodore Henry Harwood. Hoewel de Ajax zeven keer werd geraakt door de Admiral Graf Spee, slaagde het schip erin om samen met HMS Achilles en HMS Exeter de Admiral Graf Spee te beschadigen en haar op de vlucht te drijven.
De Admiral Graf Spee voer de neutrale haven van Montevideo in Uruguay binnen, maar mocht daar maar 72 uur blijven. De HMS Ajax en de HMS Achilles lagen op de loer buiten de haven en kapitein Hans Langsdorff besloot zijn schip net buiten Montevideo tot zinken te brengen.
Nadat de Admiral Graf Spee tot zinken was gebracht keerde de Ajax terug naar Engeland om tot juli 1940 in dok te gaan. Daarna werd de HMS Ajax gestationeerd in de Middellandse Zee.